諾如病毒PCR檢測(cè)糞便樣本需經(jīng)過采集、保存、運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)室處理四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。糞便樣本處理流程主要包括專用容器采集、低溫保存、生物安全運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)室核酸提取、PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1、專用容器采集：

使用醫(yī)院提供的無菌糞便采集容器，取5-10克成型糞便或5毫升稀便。避免混入尿液或消毒劑，采集后立即旋緊容器蓋，容器外標(biāo)注患者信息。嬰幼兒可使用肛拭子采集，拭子頭需完全浸入保存液。

2、低溫保存：

采集后2小時(shí)內(nèi)需將樣本置于2-8℃冷藏，超過2小時(shí)未檢測(cè)則應(yīng)冷凍于-20℃以下。病毒RNA在常溫下易降解，冷凍樣本需避免反復(fù)凍融，運(yùn)輸前需確認(rèn)樣本未泄漏。實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)會(huì)檢查樣本性狀，水樣便需額外標(biāo)注。

3、生物安全運(yùn)輸：

采用三級(jí)包裝系統(tǒng)，內(nèi)層為密封樣本管，中層為吸水性材料填充的防漏袋，外層為專用生物安全運(yùn)輸箱。運(yùn)輸箱需保持低溫并附檢測(cè)申請(qǐng)單，標(biāo)明"感染性物質(zhì)"標(biāo)識(shí)。跨機(jī)構(gòu)運(yùn)輸需符合《可感染人類的高致病性病原微生物菌毒種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》。

4、實(shí)驗(yàn)室核酸提取：

實(shí)驗(yàn)室在生物安全柜內(nèi)操作，采用胍鹽裂解法釋放病毒RNA，配合磁珠純化技術(shù)提取核酸。每批次檢測(cè)需設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，提取過程需避免氣溶膠產(chǎn)生。對(duì)于成型糞便需先進(jìn)行10%懸液制備，離心后取上清液處理。

5、PCR擴(kuò)增檢測(cè)：

使用針對(duì)諾如病毒ORF1-ORF2連接區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。反應(yīng)體系包含逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTPs和熒光探針，循環(huán)參數(shù)設(shè)置95℃預(yù)變性后，進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。結(jié)果判讀需滿足擴(kuò)增曲線S型且Ct值≤35，同時(shí)符合內(nèi)標(biāo)檢測(cè)要求。

檢測(cè)前后需注意個(gè)人防護(hù)，操作者應(yīng)穿戴醫(yī)用防護(hù)口罩、護(hù)目鏡和一次性防護(hù)服。家庭護(hù)理期間患者糞便需用含氯消毒劑處理后再?zèng)_入下水道，接觸污染物后需用肥皂流動(dòng)水洗手至少20秒。恢復(fù)期建議進(jìn)食低脂易消化食物如米粥、饅頭，避免高糖高纖維飲食加重腹瀉癥狀。檢測(cè)陰性但癥狀持續(xù)者需考慮復(fù)測(cè)或進(jìn)行輪狀病毒、腺病毒等其他腸道病原體篩查。