人偏肺病毒的q-pcr檢測(cè)主要通過(guò)核酸提取、引物探針設(shè)計(jì)、擴(kuò)增反應(yīng)、結(jié)果分析和質(zhì)控驗(yàn)證五個(gè)步驟完成。

1、核酸提取：

采用磁珠法或離心柱法從呼吸道樣本中提取病毒RNA，樣本類(lèi)型包括鼻咽拭子、肺泡灌洗液等。提取過(guò)程需在生物安全柜內(nèi)操作，防止氣溶膠污染，同時(shí)加入內(nèi)參基因監(jiān)控提取效率。提取后的RNA需立即逆轉(zhuǎn)錄或保存于零下80度環(huán)境。

2、引物探針：

針對(duì)病毒N基因或L基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針。引物長(zhǎng)度通常為18-22個(gè)堿基，Tm值控制在58-60度，探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端淬滅基團(tuán)多選用BHQ1。需通過(guò)BLAST驗(yàn)證序列特異性，避免與其他呼吸道病毒交叉反應(yīng)。

3、擴(kuò)增反應(yīng)：

采用一步法RT-qPCR體系，包含逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。反應(yīng)程序設(shè)置為50度逆轉(zhuǎn)錄15分鐘，95度預(yù)變性3分鐘后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的95度15秒、60度1分鐘兩步擴(kuò)增。每批檢測(cè)需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

4、結(jié)果分析：

根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值判定結(jié)果，通常Ct值≤37為陽(yáng)性，37-40需重復(fù)檢測(cè)，＞40為陰性。采用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，擴(kuò)增效率應(yīng)保持在90-110%之間。需注意曲線形態(tài)判斷，排除非特異性擴(kuò)增或抑制現(xiàn)象。

5、質(zhì)控驗(yàn)證：

實(shí)驗(yàn)室需定期參加室間質(zhì)評(píng)，每批次檢測(cè)需監(jiān)控內(nèi)參基因Ct值穩(wěn)定性。提取環(huán)節(jié)加入過(guò)程控制品，擴(kuò)增體系加入內(nèi)標(biāo)檢測(cè)抑制物。陽(yáng)性樣本建議進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證，新引物探針需通過(guò)靈敏度與特異性驗(yàn)證，檢測(cè)下限需達(dá)到100拷貝/毫升。

檢測(cè)前24小時(shí)避免劇烈運(yùn)動(dòng)及高脂飲食，采樣時(shí)使用無(wú)菌聚酯纖維拭子深入鼻咽部旋轉(zhuǎn)停留10秒，采樣后2小時(shí)內(nèi)送檢。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分區(qū)操作避免污染，定期校準(zhǔn)熒光定量PCR儀，操作人員需穿戴防護(hù)裝備。冬季流行季節(jié)可增加檢測(cè)頻次，免疫功能低下者出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)建議復(fù)測(cè)或聯(lián)合血清學(xué)檢查。